Сравнительная антигенность трёх препаратов ботулинического нейротоксина типа А у кроликов
JOERG BLUEMEL1, JUERGEN FREVERT2, ANITA SCHWAIER1.
1Merz Pharmaceuticals GmbH, Frankfurt, Germany;  2Biotecon Therapeutics, Potsdam, Germany

     NT 201 является новым препаратом, содержащим ботулинический нейротоксин типа А, свободным от клостридиальных гемагглютининов и нетоксиновых негемагглютининовых белков, обычно связанных с нейротоксином. Для сравнения, представленные на рынке современные препараты, содержащие ботулинический нейротоксин типа А, как правило, содержат различное количество этих клостридиальных нетоксиновых белков, которые могут усиливать иммуногенность при их терапевтическом использовании. Для сравнения иммуногенности препарата NT 201 и двух представленных на рынке препаратов BOTOX® и Dysport® была проведена оценка образования специфических, нейтрализующих ботулинический нейротоксин типа А антител на новозеландских кроликах в условиях повторных внутрикожных инъекций. Вначале сыворотку скринировали на наличие антител к ботулиническому нейротоксину типа А при помощи теста ELISA. Затем геми-диафрагмальным мышиным тестом определяли способность сывороток с положительными результатами на антитела нейтрализовать паралитическую активность ботулинического нейротоксина типа А. Учитывая потенциальную клиническую значимость клостридиальной белковой нагрузки в иммуногенности препаратов ботулинического нейротоксина типа А, данное исследование продемонстрировало, что повторные курсы лечения препаратом NT 201 в сравнении с препаратами BOTOX® или Dysport®, не вызывали образования антител, нейтрализующих ботулинический нейротоксин типа А у кроликов.

Диссоциация 900 kDa комплекса нейротоксина из C. botulinum в физиологических условиях
K.H. Eisele, H.V. Taylor (Frankfurt Main, Germany)

     Цель: Данное исследование оценивает стабильность 900 kDa комплекса нейротоксина clostridium botulinum и его диссоциацию в физиологических условиях.
     Обоснование: Медицинский препарат ботулинического нейротоксина Xeomin® состоит из 150 kDa молекулы нейротоксина, свободной от комплексных белков. В сравнение, первая генерация препаратов нейротоксина содержит 900 kDa комплекс нейротоксина, состоящий из 150 kDa молекулы нейротоксина и нескольких нетоксиновых белков, известных как комплексные белки. Существует утверждение, что эти комплексные белки пролонгируют персистенцию нейротоксина и ингибируют диффузию нейротоксина в соседние ткани.
     Методы: 900 kDA комплекс нейротоксина подвергали различным рН значениям и затем сепарировали с целью дифференцирования результирующих свойств токсина. Условия сепарации отвечали требованиям Western blot и активности токсина.
     Результаты: При физиологических значениях рН 150 kDa молекула нейротоксина выделяется из 900 kDa комплекса менее чем за минуту.
     Заключение: При физиологических значениях рН 150 kDa молекула нейротоксина выделяется из 900 kDa комплекса менее чем за минуту. Данный интервал времени является чрезвычайно коротким в сравнении со временем начала терапевтического эффекта, который измеряется несколькими днями. Таким образом, комплексные белки не могут стабилизировать нейротоксин или ингибировать его диффузию, как это утверждалось ранее. Следовательно, необходимость этих комплексных белков в медицинских препаратах должна быть поставлена под вопрос. В итоге, эти данные помогают понять клиническую эквипотентность препарата Xeomin®, 150 kDa молекулы нейротоксина, свободных от комплексных белков, и препаратов ботулинического нейротоксина, содержащих комплексные белки. Препарат Xeomin® ещё не одобрен для продаж в США.

Иммуногенность препарата NT 201 (Xeomin®) у обезьян Cynomolgus после повторных инъекций больших доз
Eisele, KH, Taylor HV and Bluemel, J.
Merz Pharmaceuticals GmbH, Frankfurt, Germany

     Ботулинические токсины широко используются как при клиническом лечении мышечных спазмов и дистоний, так и при эстетических показаниях. В некоторых случаях, терапия ботулиническим токсином ассоциируется с эпизодами выявления у лечившихся пациентов титров антител. Предположительно, появление антител коррелирует с частотой применения ботулинического токсина. Антитела, направленные против нейротоксина, могут негативно влиять на терапевтический эффект за счёт частичной нейтрализации фармакологической активности. Иммунологические свойства коммерчески доступных препаратов ботулинических токсинов различаются в зависимости от используемого серотипа, общей белковой нагрузки и наличия или отсутствия в препарате нетоксиновых комплексных белков.
Целью настоящего исследования была оценка вопроса, вызывает ли NT 201 (Xeomin®), препарат ботулинического токсина типа А, свободный от комплексных белков, образование антител, направленных против нейротоксина, после повторных инъекций больших доз с интервалами назначения короче обычно используемых в клинике. Таким образом, трём самцам и трём самкам обезьян Cynomolgus (Macaca fascicularis) были выполнены 4 внутримышечные инъекции с интервалами 4 недели в дозах 0, 4 ЕД, 8 ЕД или 16 ЕД на килограмм массы тела в левую икроножную мышцу. В конце исследования на 13-й неделе были собраны образцы крови для последующего выполнения иммунологического анализа. Образцы плазмы всех животных были подвергнуты валидированному флуоресцентному иммунологическому анализу, специфичному к антителам, направленным против 150 kDa ЕД ботулинического нейротоксина серотипа А. В случае выявления определяемых уровней антител (LLOD 0.22 mU/mL) выполнялась функциональная оценка, определяющая специфичность связывания, для последующего разграничения между токсин-нейтрализующими и не-нейтрализующими свойствами. Достаточная экспозиция животных в группах со всеми дозировками демонстрировалась клиническими признаками, связанными с фармакологическим действием локального паралича мышц (например, хромота). Заметная потеря массы тела (от 10% до 20% от начальной массы тела), отмеченная при дозе 16 ЕД на килограмм массы тела, подчёркивает высокий уровень воздействия, достигнутый при данной схеме назначения. Флуоресцентный иммунологический анализ всех образцов плазмы не выявил определяемого титра антител. Таким образом, был сделан вывод, что повторные инъекции больших дозировок, включая оба клинических способа применения и тканей-мишеней, но при укороченных интервалах назначения не привели к определяемому титру антител в исследовании данной животной модели обезьян. Полученные результаты подтверждают предположение о том, что сниженная белковая нагрузка в препарате за счёт удаления комплексных белков, может быть благоприятным показателем для терапевтического использования ботулинических токсинов.

Xeomin® не содержит комплексных белков
Jurgen Frevert
Merz Pharmaceuticals GmbH, Postdam, Germany.

     По сравнению с другими препаратами, представленными на рынке, Xeomin® содержит только терапевтически активный белок, 150kDa ботулинического нейротоксина типа А. Путём нескольких физико-химических процедур может быть наглядно продемонстрировано отсутствие в препарате других клостридиальных белков. Следовательно, Xeomin® является препаратом с наивысшей специфической активностью.
     В клинических исследованиях, было показано, что очищенный нейротоксин одинаково эффективен с другими препаратами ботулинического токсина, а дополнительные клостридиальные белки не способствуют терапевтическому эффекту. Комплекс нейротоксина стабилен только в кислой pH среде, и сразу же после инъекции в мышцу, попадая в физиологическую pH среду, диссоциирует, освобождая 150 kDa активного нейротоксина. Таким образом, комплексные белки не влияют на степень диффузии как риск побочных эффектов, вызванных распространением нейротоксина. Для сравнения, комплексные белки, действуя как лектины, могут иметь негативное воздействие на терапевтическое использование.
     Препарат Xeomin® при комнатной температуре является стабильным на протяжении до 4-х лет, и не требует охлаждения, демонстрируя то, что комплексные белки не требуются для стабилизации нейротоксина в препарате.

Локомоторная терапия пациентов с хроническим гемипарезом после лечения эквиноварусной деформации очищенным ботулиническим токсином типа А (Xeomin®).
Cordula Werner1 and Stefan Hesse2
Charite – University Medicine Berline, Medical Park Berline,
Germany; Medical Park Berline, Germany.

     Введение / Цели: Всё больше и больше пациентов с хроническим инсультом интересуются аэробными тренировками на тредмилле с целью улучшения походки. Эквиноварусная деформация стопы может препятствовать эффективной тренировке за счёт выраженной болезненности или из-за неприемлемого риска растяжения лодыжки, несмотря на использование ортоза.
     Участники, Материалы / Методы: Для борьбы с этой проблемой был создан протокол комбинированного применения внутримышечных инъекций ботулинического токсина типа А и локомоторной терапии, начинающейся через одну неделю после выполнения инъекции. Для сведения к минимуму риска образования антител использовали очищенный токсин (XEOMIN®, 300 ЕД). Быстрое растяжение инъецированной икроножной мышцы непосредственно сразу после выполнения инъекции и предписание начинать ходить как можно позже, было нацелено на повышение эффективности токсина, а аэробные тренировки на тредмилле включали систематическое увеличение скорости и наклона. Для достижения эффекта тренировки пациенты должны были достичь заранее установленный уровень числа сердечных сокращений.
     Результаты: В исследовании приняли участие десять пациентов с хроническим инсультом, не было выявлено никаких нежелательных побочных эффектов, инъекции ботулинического токсина типа А привели к эффективному уменьшению деформации, а пациенты смогли увеличить скорость (выносливость) в среднем на 0.14 м/сек (44.3 м). Пациенты были удовлетворены результатами лечения.
     Заключение: В итоге, комбинация инъекций ботулинического токсина типа А с аэробными тренировками на тредмилле помогла помочь пациентам с хроническим инсультом и эквиноварусной деформацией стопы существенно улучшить походку.

Xeomin® является стабильным без охлаждения: комплексные белки не требуются для сохранения стабильности препаратов ботулинического нейротоксина типа А
Swen Grein, Gerd J. Mander, Harold V. Taylor
Merz Pharmaceuticals GmbH, Frankfurt am Main, Germany.

     Нативный ботулинический токсин типа А является комплексом с большим молекулярным весом около 900 kDa, состоящим из биологически активного 150 kDa нейротоксина, нескольких гемагглютининов и других нетоксиновых белков. Хотя эти комплексные белки не оказывают какого-либо терапевтического эффекта, предполагается, что они могут быть необходимыми для стабильности препаратов ботулинического нейротоксина типа А.
     Xeomin® - препарат ботулинического нейротоксина типа А, который, в отличие от других представленных на рынке препаратов ботулинического токсина типа А, содержит только чистый 150 kDa нейротоксин без комплексных белков. Согласно критериям ICH, стабильность препарата Xeomin® была оценена во всестороннем исследовании реального времени и увеличенной стабильности. Результаты данного исследования показали отсутствие нежелательных влияний на качество препарата Xeomin® при хранении в температурных условиях до 40°С и определили срок хранения в 3 года без необходимости охлаждения. 
     При следующем стрессовом температурном исследовании образцы препарата Xeomin® хранились в условиях свыше 40°С. Как и в исследованиях стабильности, соответствовавших ICH, для реализации тестирования Xeomin® также использовали полностью валидированные или стандартизированные аналитические методы фармакопеи. Результаты показали, что хранение в температурных условиях между 40 и 60°С в течение одного месяца не оказывало негативного влияния на препарат Xeomin®.
     В целом, полученные данные предоставили четкие доказательства того, что комплексные белки в фармацевтических препаратах ботулинического нейротоксина типа А не являются необходимыми составляющими для обеспечения их стабильности.

Высокая доза, повторная инъекция препарата ботулинического нейротоксина типа А, не содержащего комплексных белков, у обезьян
Eisele, KH, Taylor HV and Blumel, J
Merz Pharmaceuticals GmbH, Frankfurt, Germany

     Введение: Ботулинические нейротоксины широко используются в лечении мышечных спазмов и дистоний, а также в эстетической терапии. 
В некоторых случаях у пациентов, получавших терапию ботулиническим токсином, выявляют определяемые титры антител. Эти антитела могут оказывать негативное влияние на терапевтическую эффективность, по крайней мере, частично нейтрализуя фармакологическую активность нейротоксина. 
Иммунологические свойства коммерчески доступных препаратов ботулинического нейротоксина различаются в зависимости от используемого типа серотипа, общего количества белковой нагрузки и наличия или отсутствия нетоксиновых комплексных белков в препарате.
Цель настоящего исследования – оценить может ли NT 201 (Xeomin®), препарат ботулинического токсина типа А, не содержащий комплексных белков, провоцировать формирование антител, направленных против нейротоксина после повторных инъекций высокой дозы с интервалами, более короткими, чем те, которые обычно используют в клинических условиях.
     Материалы и методы: Три Cynomolgus обезьяны (Macaca fascicularis) женского и мужского пола в группе каждой из дозировок были инъецированы внутримышечно 4 раза с интервалами 4 недели в дозах 0, 4, 8 или 16 ЕД на кг веса тела в левую икроножную мышцу. После окончания исследования через 13 недель были взяты образцы крови для иммунологического анализа. 
Образцы плазмы всех животных были проанализированы с помощью валидированного флуоресцентного иммунологического исследования, специфического для антител, направленных против 150 kDa ботулинического нейротоксина серотипа А. 
Анализ антител был проведен в соответствии со статьей о тестировании иммуногенности Mire-Sluis и соавт. (2004). Флуоресцентный иммунологический анализ выполняли в так называемом формате мостика, использующего DELFIAtm систему детекции на EnVisiontm плате микротитра (PerkinElmer).
В случае выявления уровней антител (LLOD 0.22mU/мл) позже выполняли функциональный анализ, тестирующий специфичность связывания с целью определения токсин-нейтрализующих и не нейтрализующих свойств.
Достаточная экспозиция животных была продемонстрирована клиническими признаками, связанными с фармакологическим действием локального мышечного паралича (например, слабый) во всех группах дозировок.
     Результаты: В данном исследовании все животные остались живыми. В группе с дозировкой 16 ЕД/кг веса тела отмечалась заметная потеря веса тела (10-20% от исходной величины веса тела), подчеркивавшая высокий уровень экспозиции, достигнутый при данной схеме введения. 
Полученные результаты исследования антител представлены в таблице 1. Ни у одной из обезьян не были определены антитела против ботулинического нейротоксина серотипа А. 

Таблица 1. Титры антител Cynomolgus обезьян в 13-недельном исследовании по данным флуоресцентного иммунологического анализа. Правильное проведение анализа контролировали с помощью позитивных или негативных контролей. Конечные значения исследования для негативных образцов были определены как 317.1, 452.8 и 433.2 относительных флуоресцентных единиц.

Животное	
Средний сигнал

Результат	
	Образец 1	Образец 2		
2531	184.5	306.0	negative	
2532	278.0	310.0	negative	
2533	306.0	238.5	negative	
2534	298.0	175.8	negative	
2535	310.5	217.5	negative	
2536	297.3	268.3	negative	
2537	210.3	282.0	negative	
2538	266.0	291.3	negative	
2539	183.0	228.3	negative	
2540	248.0	302.0	negative	
2541	250.8	210.3	negative	
2542	250.0	240.0	negative	
2543	202.0	315.0	negative	
2544	242.5	301.5	negative	
2545	238.5	254.0	negative	
2546	228.0	252.0	negative	
2547	306.5	262.0	negative	
2548	260.0	320.0	negative	
2549	248.0	300.0	negative	
2550	294.3	332.0	negative	
2551	216.0	199.5	negative	
2552	330.5	210.3	negative	
2553	313.5	204.0	negative	
2554	332.0	282.3	negative	

     Выводы: Анализ антител в образцах плазмы выявил неопределяемый титр антител в каждом образце плазмы обезьян. Соответственно повторные инъекции высоких дозировок, используя клинические путь введения и ткань-мишень, но с более короткими интервалами, не привели к формировании определяемых уровней титров антител у животной модели обезьян.
Данные результаты поддерживают гипотезу о том, что сниженная белковая нагрузка в препарате после очистки может иметь положительное значение при терапевтическом использовании ботулинических нейротоксинов.

     Резюме:
Три Cynomolgus обезьяны (Macaca fascicularis) женского и мужского пола в группе каждой из дозировок были инъецированы внутримышечно 4 раза с интервалами 4 недели в дозах 0, 4, 8 или 16 ЕД на кг веса тела в левую икроножную мышцу. После окончания исследования через 13 недель были взяты образцы крови для иммунологического анализа.
Образцы плазмы всех животных были проанализированы с помощью валидированного флуоресцентного иммунологического исследования, специфического для антител, направленных против 150 kDa ботулинического нейротоксина серотипа А. В случае выявления уровней антител (LLOD 0.22mU/мл) позже выполняли функциональный анализ, тестирующий специфичность связывания с целью определения токсин-нейтрализующих и не нейтрализующих свойств.
Достаточная экспозиция животных была продемонстрирована клиническими признаками, связанными с фармакологическим действием локального мышечного паралича (например, слабый) во всех группах дозировок. В группе с дозировкой 16 ЕД/кг веса тела отмечалась заметная потеря веса тела (10-20% от исходной величины веса тела), подчеркивавшая высокий уровень экспозиции, достигнутый при данной схеме введения. 
Флуоресцентный иммунологический анализ образцов плазмы выявил не определяемый титр антител во всех образцах плазмы. Таким образом, был сделан вывод о том, что повторные инъекции высоких дозировок, используя клинические путь введения и ткань-мишень, но с более короткими интервалами, не привели к формировании определяемых уровней титров антител у использованной животной модели обезьян. Данные результаты поддерживают гипотезу о том, что сниженная белковая нагрузка нагрузка в препарате после очистки может иметь положительное значение при терапевтическом использовании ботулинических нейротоксинов.

Цитированная литература
1. A.R. Mire-Sluis, Y.C. Barrett, V. Devanarayan, E. Koren, H. Liu, M. Maia, T. Parish, G Scott, G. Shankar, E Shores, S.J. Swanson, G. Taniguchi, D. Wisrda, L.A.  Zuckerman White paper: “Recommendations for the design and optimization of immunoassays used in the detection of host antibodies against biotechnology products”, Journal of immunological Methods 289 (2004) 1-16.